Plásmido CRISPR de Activación (h) Rbx1: sc-402733-ACT

RBX1 codifica Rbx1, una subunidad tipo RING-box de las ligasas E3 de ubiquitina Cullin–RING (CRL), que catalizan la transferencia de ubiquitina para regular la degradación proteasómica de proteínas celulares clave. A través de CRL1/SCF y complejos relacionados, Rbx1 influye en la progresión del ciclo celular, las respuestas al estrés de replicación del ADN y la transducción de señales al controlar el recambio de ciclinas, inhibidores de CDK y reguladores de vías. La ubiquitinación dependiente de RBX1 se interconecta con la neddilación de las culinas, acoplando la activación de las CRL a la proteostasis y al control de los puntos de control. La actividad desregulada de RBX1/CRL se asocia con proliferación alterada y estabilidad genómica comprometida, lo que convierte a RBX1 en un nodo relevante para estudiar la señalización oncogénica, la adaptación al estrés y las vulnerabilidades de la vía de ubiquitina en células humanas.

Rbx1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RBX1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rbx1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RBX1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RBX1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rbx1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RBX1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rbx1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rbx1 en células tumorales con expresión de RBX1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.