Plasmide CRISPR d'Activation (h) RBP: sc-401569-ACT

Le gène humain RBP4 code la protéine de liaison au rétinol 4 (RBP), principal transporteur de vitamine A (rétinol) dans la circulation et déterminant clé de l’acheminement des rétinoïdes vers les tissus périphériques. En régulant la disponibilité du rétinol, RBP4 influence des programmes transcriptionnels dépendants de l’acide rétinoïque qui gouvernent la différenciation épithéliale, la modulation immunitaire et l’organisation du développement, et s’articule avec la sécrétion hépatique ainsi qu’avec les processus du métabolisme lipidique. Des modifications de l’expression de RBP4 et de l’homéostasie des rétinoïdes ont été associées à une dérégulation métabolique, à l’insulinorésistance et à des phénotypes inflammatoires, ainsi qu’à la biologie oculaire et hépatique, où le flux de vitamine A est étroitement contrôlé. RBP4 constitue donc un nœud utile pour disséquer les voies de transport des rétinoïdes et les réseaux de régulation génique en aval dans des modèles de cellules humaines.

RBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RBP4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RBP4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RBP4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RBP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RBP4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RBP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RBP dans les cellules tumorales présentant une expression de RBP4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.