RBM35A CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-405645-ACT-2

Das humane ESRP1 (epithelial splicing regulatory protein 1; RBM35A) kodiert einen RNA-bindenden Spleißfaktor, der GU-reiche Motive erkennt und dadurch alternative Spleißprogramme steuert, die für Epithelzellen charakteristisch sind. ESRP1 trägt zur Aufrechterhaltung der epithelialen Identität bei, indem es die Isoformauswahl in Transkripten koordiniert, die an Zell-Zell-Adhäsion, Zytoskelettorganisation, Polarität und signalvermittelten Netzwerken beteiligt sind, die mit der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) verknüpft sind, einschließlich Signalwegen mit Überschneidungen zur Regulation von FGFR- und CD44-Isoformen. Eine fehlregulierte ESRP1-vermittelte Spleißung wurde in mehreren epithelderivierten Krebsarten mit veränderten EMT-Zuständen und Tumorprogressionsphänotypen in Verbindung gebracht, was ESRP1 als einen zentralen Knotenpunkt der Veränderungen in der RNA-Prozessierung nahelegt, die während metastaseassoziierter Umbauprozesse beobachtet werden. Die Geneditierung von ESRP1 ermöglicht mechanistische Untersuchungen der spleißabhängigen Regulation, isoformaufgelöste Transkriptomik sowie die funktionelle Analyse von EMT- und epithelialen Differenzierungsprogrammen in menschlichen Zellmodellen.

RBM35A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ESRP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RBM35A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ESRP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ESRP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RBM35A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ESRP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RBM35A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RBM35A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ESRP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.