RBFOX3/NeuN CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402976-ACT

RBFOX3, auch als NeuN bekannt, kodiert ein in Neuronen angereichertes RNA-bindendes Protein, das UGCAUG-Motive erkennt und dadurch alternative Spleißprogramme reguliert, die für neuronale Differenzierung, synaptische Reifung und die Aufrechterhaltung der neuronalen Identität essenziell sind. Durch die Steuerung der Exon-Inklusion und des Gleichgewichts von mRNA-Isoformen ist RBFOX3 in posttranskriptionelle Netzwerke eingebunden, die die Zytoskelettdynamik, das Neuritenauswachsen und die aktivitätsabhängige Genexpression prägen. Von der RBFOX-Familie gesteuertes Spleißen ist mit Signalwegen verknüpft, die das Gleichgewicht zwischen Erregung und Hemmung sowie die neuronale Konnektivität regulieren, wodurch RBFOX3 ein weit verbreiteter Marker und Regulator in Studien zur neuronalen Entwicklung und Funktion ist. Fehlregulierte neuronale Spleißprogramme unter Beteiligung von RBFOX-Faktoren wurden mit Mechanismen neuroentwicklungsbedingter und neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht, was seine Relevanz für die Modellierung von Defekten der RNA-Prozessierung in humanen Systemen unterstreicht.

RBFOX3/NeuN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RBFOX3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RBFOX3/NeuN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RBFOX3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RBFOX3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RBFOX3/NeuN-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RBFOX3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RBFOX3/NeuN-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RBFOX3/NeuN-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RBFOX3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.