Particules Lentivirales d'Activation (h) Ras-GRF2: sc-404141-LAC

Le gène humain RASGRF2 code Ras-GRF2, un facteur d’échange de nucléotides guanyliques régulé par le calcium et la calmoduline, qui active Ras et d’autres petites GTPases apparentées, reliant l’activité neuronale et les signaux des facteurs de croissance à la signalisation MAPK/ERK. En modulant la plasticité synaptique, l’extension des neurites et des programmes transcriptionnels dépendants de l’activité, Ras-GRF2 contribue à des processus cellulaires tels que la différenciation, la migration et le remodelage du cytosquelette. Des dynamiques aberrantes de la voie Ras ainsi qu’une expression, une régulation ou un contrôle altérés de RASGRF2 ont été associés à des états de signalisation déréglés pertinents pour la biologie du cancer et des phénotypes neurobiologiques. RASGRF2 est donc étudié comme un nœud de signalisation en amont qui façonne la sortie ERK dépendante du stimulus et les réseaux d’expression génique en aval.

Les particules d'activation lentivirales Ras-GRF2 (h) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de RASGRF2 dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales Ras-GRF2 (h) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription RASGRF2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de Ras-GRF2. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif RASGRF2 ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.