Plásmido CRISPR de Activación (h) RAPGEF6: sc-403816-ACT

RAPGEF6 (también conocido como PDZ-GEF2) codifica un factor de intercambio de nucleótidos de guanina específico de Rap que activa las GTPasas RAP1 y RAP2 para coordinar la señalización de integrinas de adentro hacia afuera, la remodelación del citoesqueleto y la dinámica de las uniones célula-célula. Mediante la regulación de vías dependientes de Rap, RAPGEF6 contribuye al control de la adhesión, la migración y la polaridad celulares en múltiples contextos tisulares. Su actividad se integra con redes de señalización aguas abajo de receptores que influyen en los circuitos de MAPK y de pequeñas GTPasas, modulando el tráfico celular y la señalización proximal a la membrana. La desregulación de la señalización de Rap y de los programas de adhesión vinculados a RAPGEF6 es relevante para estudios sobre comportamiento celular invasivo, tráfico de células inmunitarias y otras alteraciones asociadas a enfermedades en la organización tisular.

RAPGEF6 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RAPGEF6 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RAPGEF6 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RAPGEF6 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RAPGEF6, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RAPGEF6. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RAPGEF6 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RAPGEF6 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RAPGEF6 en células tumorales con expresión de RAPGEF6 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.