Rap 2A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403109-ACT

RAP2A kodiert die humane kleine GTPase Rap2A, ein Mitglied der Ras-Superfamilie, das zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen wechselt und so die Signaltransduktion an Zellmembranen reguliert. Rap2A ist an Signalwegen beteiligt, die den Umbau des Aktinzytoskeletts, integrinvermittelte Adhäsion, Zellpolarität und vesikulären Transport steuern, und beeinflusst damit Prozesse wie Migration und Neuritenauswachsung. Über Interaktionen mit Effektoren, die mit der MAPK-Signalgebung und Netzwerken der Rho-Familie von GTPasen gekoppelt sind, trägt RAP2A zur Koordination der räumlichen Kontrolle von Proliferation und Motilitätssignalen bei. Eine fehlregulierte Rap2A-Signalgebung wurde im Zusammenhang mit onkogener Transformation, Invasionsphänotypen sowie in der Neuro- und Gefäßbiologie untersucht, wo veränderte Adhäsion und Zytoskelettdynamik eine Rolle spielen.

Rap 2A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAP2A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rap 2A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAP2A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAP2A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rap 2A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAP2A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rap 2A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rap 2A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAP2A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.