Plasmide CRISPR d'Activation (h) RAMP3: sc-402235-ACT

La protéine 3 modifiant l’activité des récepteurs (RAMP3) est une protéine accessoire membranaire à passage unique qui forme des hétérodimères avec certains RCPG de classe B, notamment le récepteur de type calcitonine (calcitonin receptor-like receptor) et le récepteur de la calcitonine, afin de déterminer la spécificité des ligands, le trafic des récepteurs et le biais de signalisation en aval. En façonnant les complexes récepteurs de la famille adrénomédulline/CGRP, RAMP3 influence les voies dépendantes de l’AMPc ainsi que des processus plus larges tels que la signalisation endothéliale, la fonction de barrière et l’homéostasie cellulaire, via la modulation de l’internalisation et du recyclage des récepteurs. Une expression altérée de RAMP3 a été associée à des programmes de signalisation des RCPG dérégulés, pertinents pour la physiologie cardiovasculaire et les réseaux de signalisation associés aux tumeurs, ce qui soutient son utilisation comme nœud d’étude mécanistique de la pharmacologie des récepteurs et de la régulation des états cellulaires. Ces propriétés font de RAMP3 humain une cible utile pour disséquer l’assemblage des complexes récepteurs et la dynamique de transduction du signal dans des modèles cellulaires pertinents sur le plan physiologique.

RAMP3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAMP3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RAMP3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAMP3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAMP3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RAMP3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAMP3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RAMP3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RAMP3 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAMP3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.