Ral A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403983-ACT

RALA codifica a pequena GTPase RalA, um interruptor molecular do tipo Ras que alterna entre os estados ligados a GDP e a GTP para coordenar o tráfego vesicular, a exocitose e a remodelação do citoesqueleto de actina. Por meio de sinalização dependente de RalGEF, a RalA interage com efetores como o complexo exocisto e a RalBP1 para regular a dinâmica de membrana, a reciclagem de receptores e a polaridade celular. A atividade de RalA integra-se a redes associadas a Ras/MAPK e PI3K, conectando estímulos de fatores de crescimento a mudanças em migração, adesão e proliferação. A desregulação da sinalização de RalA tem sido associada a comportamento invasivo alterado e à modulação da saída de vias oncogênicas em múltiplos contextos de câncer, tornando-a um nó útil para estudar a especificidade de ramos efetores de Ras e fenótipos de tráfego de membrana.

Ral A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RALA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ral A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RALA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RALA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ral A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RALA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ral A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ral A em células tumorais com expressão de RALA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.