Rak CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405590-ACT

Das humane FRK kodiert Rak, eine nicht‑rezeptorische Tyrosinkinase der BRK‑Familie, die die intrazelluläre Signalübertragung moduliert, indem sie Substrate phosphoryliert, die an Wachstumsfaktorantworten, Adhäsion und der Organisation des Zytoskeletts beteiligt sind. Rak wird mit der Regulation der epithelialen Differenzierung und der Zellzykluskontrolle in Verbindung gebracht, über Signalwege, die mit der Rezeptor‑Tyrosinkinase‑Signalgebung sowie nachgeschalteten Komponenten der MAPK/ERK‑ und PI3K/AKT‑Netzwerke zusammenlaufen. Veränderte FRK‑Expression oder eine verschobene Signalbalance wurde mit Änderungen in Proliferation, Migration und Stressantworten assoziiert, die in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten, einschließlich der Krebsbiologie, beobachtet werden. Als Knotenpunkt in kinasengesteuerten Signalkreisläufen wird FRK häufig untersucht, um zu klären, wie Tyrosinphosphorylierung Transkriptionsprogramme und phänotypische Zustände umgestaltet.

Rak Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FRK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rak Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FRK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FRK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rak-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FRK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rak-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rak-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FRK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.