Particules Lentivirales d'Activation (h) Raf-1: sc-400202-LAC

Le gène humain **RAF1** code Raf-1, une kinase sérine/thréonine qui constitue un nœud central de la voie MAPK, reliant les petites GTPases de la famille RAS activées à la signalisation MEK1/2 et ERK1/2. Raf-1 intègre des signaux provenant des récepteurs à activité tyrosine kinase et de diverses protéines d’échafaudage afin de réguler la prolifération, la différenciation, la survie et les réponses au stress, avec des rôles additionnels dans la dynamique du cytosquelette et la signalisation mitochondriale. Une activité dérégulée de RAF1 contribue à une sortie ERK aberrante observée dans de multiples contextes de signalisation liés au cancer et est également impliquée dans des phénotypes de RASopathies via une hyperactivation de la voie et une altération de la signalisation du développement. Ainsi, RAF1 constitue un point d’entrée mécanistique pour étudier les rétrocontrôles de la voie, le contrôle de l’amplitude et de la durée du signal, ainsi que les interactions croisées avec PI3K/AKT et les régulateurs de l’apoptose.

Les particules d'activation lentivirales Raf-1 (h) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de RAF1 dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales Raf-1 (h) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription RAF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de Raf-1. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif RAF1 ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.