Radixin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403440-ACT

Das humane RDX-Gen kodiert Radixin, einen Zytoskelett-Adapter der ERM-Familie, der kortikales F‑Aktin mit Transmembranproteinen verbindet, um Membrandomänen zu organisieren, die Zellform zu regulieren sowie Zell‑Zell- und Zell‑Matrix-Kontakte zu stabilisieren. Radixin ist an der Umgestaltung des Aktinkortex an Strukturen wie Mikrovilli und Adhäsionsstellen beteiligt und integriert Signale über Rho-Familien-GTPasen, PI3K-abhängige Signalwege und Scaffold-Komplexe, die die Lokalisation und das Trafficking von Rezeptoren koordinieren. Über seine Rolle in der Mechanotransduktion und der Kopplung von Membran und Zytoskelett beeinflusst Radixin Prozesse wie epitheliale Polarität, Migration und Endozytose. Eine fehlregulierte ERM-Funktion sowie veränderte RDX-Expression oder -Lokalisation wurden mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Krebszellinvasion und Metastasierung relevant sind, ebenso wie mit gewebespezifischen Störungen in Barriere- und neuronalen Kontexten.

Radixin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RDX-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Radixin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RDX-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RDX-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Radixin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RDX-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Radixin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Radixin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RDX-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.