Plásmido CRISPR de Activación (h) Rad54: sc-401750-ACT

RAD54L codifica la ATPasa humana Rad54 dependiente de ADN, un factor de remodelación de la cromatina de la familia SWI2/SNF2 que actúa en conjunto con RAD51 para promover la búsqueda de homología, la formación de D-loops y la migración de rama durante la recombinación homóloga. Rad54 participa en la respuesta al daño del ADN para resolver lesiones asociadas a la replicación y roturas de doble cadena, favoreciendo la estabilidad del genoma mediante vías de reparación en las fases S y G2. La alteración de la actividad de RAD54L puede perturbar la fidelidad de la recombinación y contribuir a la carga mutacional y a los reordenamientos cromosómicos observados en biología del cáncer y en contextos hereditarios de inestabilidad genómica. Por ello, RAD54L se estudia ampliamente en los mecanismos de estrés replicativo, la reparación mediada por recombinación y la elección de vía entre recombinación homóloga y unión de extremos.

Rad54 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RAD54L sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rad54 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RAD54L en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RAD54L, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rad54. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RAD54L y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rad54 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rad54 en células tumorales con expresión de RAD54L silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.