Rad1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403600-ACT

Humanes RAD1 kodiert Rad1, eine Kernkomponente der RAD9A–HUS1–RAD1-(9-1-1)-Checkpoint-Klammer, die an geschädigte DNA geladen wird, um die Genomüberwachung zu koordinieren. Rad1 unterstützt die ATR-vermittelte Signalübertragung, fördert die Stabilität von Replikationsgabeln und ist mit DNA-Reparaturwegen einschließlich Basenexzisionsreparatur und Nukleotidexzisionsreparatur verknüpft, um die chromosomale Integrität zu erhalten. Über diese Funktionen beeinflusst RAD1 die Kontrolle von Zellzyklus-Checkpoints, Reaktionen auf Replikationsstress und die Behebung von DNA-Läsionen, die andernfalls genomische Instabilität verursachen. Eine fehlregulierte Checkpoint- und Reparaturkapazität unter Beteiligung des 9-1-1-Komplexes wurde in experimentellen Modellen mit krebsassoziierten DNA-Schadensphänotypen und einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber genotoxischem Stress in Verbindung gebracht.

Rad1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rad1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rad1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rad1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rad1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.