Rac 3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403445-ACT

RAC3 kodiert Rac 3, ein Mitglied der Rho-Familie kleiner GTPasen, das zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen wechselt, um den Umbau des Aktin-Zytoskeletts und die Membrandynamik zu koordinieren. Rac 3 ist an Signalnetzwerken beteiligt, die Zellmigration, Adhäsion, Neuritenauswachsung und vesikulären Transport über nachgeschaltete Effektoren regulieren, darunter PAK-Kinasen, WAVE/Arp2/3 und PI3K-assoziierte Signalwege. In menschlichen Zellen wurde eine veränderte RAC3-Aktivität mit einer fehlregulierten Kontrolle des Zytoskeletts und transkriptionellen Programmen in Verbindung gebracht, die Proliferation und invasive Phänotypen in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten beeinflussen. Diese Eigenschaften machen RAC3 zu einem geeigneten Knotenpunkt, um das Crosstalk zwischen Rho-GTPase-Signalen, rezeptorvermittelten Eingängen und zytoskelettabhängigen zellulären Verhaltensweisen zu untersuchen.

Rac 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAC3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rac 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAC3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAC3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rac 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAC3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rac 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rac 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAC3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.