Plásmido CRISPR de Activación (h) Rab 8A: sc-404285-ACT

RAB8A codifica la pequeña GTPasa Rab8A, un regulador central del tráfico de membranas post-Golgi que coordina la exocitosis polarizada, la gemación de vesículas y su anclaje durante la entrega de carga a la membrana plasmática y al cilio primario. Rab8A actúa en conjunto con GEF y efectores para controlar la dinámica de los endosomas de reciclaje, la ciliogénesis y la organización del citoesqueleto, influyendo así en la polaridad celular y la migración dirigida. A través de estas funciones, RAB8A participa en vías vinculadas a la biología de las ciliopatías y a la señalización del desarrollo, y su desregulación se ha asociado con programas de secreción alterados y comportamientos celulares invasivos en contextos relacionados con el cáncer. El tráfico dependiente de Rab8A también se conecta con el transporte neuronal y la remodelación de membranas asociada a la autofagia, lo que lo hace relevante para estudios mecanísticos en diversos tejidos.

Rab 8A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RAB8A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rab 8A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RAB8A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RAB8A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rab 8A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RAB8A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rab 8A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rab 8A en células tumorales con expresión de RAB8A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.