Rab 7 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422571-ACT

Rab7 kodiert Rab7, eine kleine GTPase, die die Reifung später Endosomen, den Endosom–Lysosom-Transport und die Positionierung von Lysosomen über die koordinierte Rekrutierung von Effektoren reguliert, welche Vesikelbeweglichkeit und Membranfusion steuern. In Mauszellen ist Rab7 zentral für den autophagischen Flux, indem es die Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen fördert und den Abbau endozytierter Fracht unterstützt; dadurch beeinflusst es den Rezeptorumsatz und Nährstoffsensorik-Signalwege. Eine Störung des Rab7-abhängigen Transports beeinträchtigt die lysosomale Homöostase und kann die Antigenprozessierung, die mitochondriale Qualitätskontrolle und neuroimmunologische Signalwege beeinflussen. Veränderte Rab7-Aktivität wurde mit pathologischen Mechanismen in Verbindung gebracht, die Neurodegeneration, periphere Neuropathie und Infektionsbiologie betreffen, vermittelt durch Defekte im intrazellulären Transport und in abbauenden Signalwegen.

Rab 7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Rab7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Rab7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Rab7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Rab7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Rab7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.