Rab 5C CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403247-ACT

Humanes RAB5C kodiert Rab 5C, eine kleine GTPase, die die Fusion früher Endosomen, die rezeptorvermittelte Endozytose und die Dynamik des endosomalen Traffickings reguliert, welche Membranrecycling und die Dauer von Signalübertragung prägen. Durch den Wechsel zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen koordiniert Rab 5C die Rekrutierung von Effektoren, die an Vesikel-Tethering, Fracht-/Cargo-Sortierung und Phosphoinositid-Remodelling beteiligt sind, und beeinflusst dadurch Signalwege wie den Turnover von Wachstumsfaktor-Rezeptoren und die Nährstoffaufnahme. Die Aktivität der Rab5-Familie ist mit dem Zytoskelett-abhängigen Transport und der Endosom-zu-Lysosom-Routung verknüpft und wirkt sich auf Prozesse wie Proliferation, Polarität und Reaktionen auf extrazelluläre Signale aus. Eine Fehlregulation des endozytotischen Traffickings und der Rab5-abhängigen Signalübertragung wurde mit krebsassoziierter Rezeptor-Hyperaktivierung, neurodegenerativen Mechanismen infolge von Defiziten im Vesikeltransport sowie mit Infektionsbiologie in Verbindung gebracht, bei der Pathogene endosomale Eintrittswege des Wirts ausnutzen.

Rab 5C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB5C-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 5C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB5C-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB5C-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 5C-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB5C-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 5C-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 5C-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB5C-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.