Rab 4A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401828-ACT

RAB4A kodiert die kleine GTPase Rab4A, einen zentralen Regulator der Dynamik früher Endosomen und des schnellen Recyclings internalisierter Fracht zurück zur Plasmamembran. Rab4A koordiniert Vesikelabschnürung, -beweglichkeit und -ankopplung durch Interaktionen mit endosomalen Effektoren und beeinflusst damit den Transport von Rezeptoren und Transportern, die Signaltransduktion und Membranzusammensetzung modulieren. Über die Kontrolle des endozytotischen Recyclings wirkt sich RAB4A auf Prozesse wie den Umsatz von Wachstumsfaktorrezeptoren, die Nährstoffaufnahme und das Remodeling des Zytoskeletts aus. Eine fehlregulierte Rab4A-abhängige Trafficking-Steuerung wurde im Zusammenhang mit onkogenem Signaling, metabolischer Regulation und neurodegenerativen Phänotypen untersucht, bei denen eine veränderte Endosomenfunktion die zelluläre Homöostase stört.

Rab 4A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB4A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 4A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB4A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB4A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 4A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB4A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 4A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 4A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB4A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.