Rab 27b CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403498-ACT

RAB27B kodiert die kleine GTPase Rab27b, ein Mitglied der Rab-Familie, die Membrantransportvorgänge reguliert, die für das Andocken, Priming und die Fusion sekretorischer Vesikel mit der Plasmamembran erforderlich sind. Über Interaktionen mit Effektorproteinen wie synaptotagminähnlichen Proteinen und Rab27-spezifischen Bindungspartnern koordiniert Rab27b die regulierte Exozytose, die Reifung von Granula und die Freisetzung von Fracht in sekretorischen sowie immunbezogenen Kontexten. Dieser Signalweg trägt zu Prozessen wie der Sekretion dichter Granula in Thrombozyten, dem Vesikeltransport in endokrinen Zellen und der Kontrolle der Freisetzung extrazellulärer Vesikel/Exosomen bei und verknüpft RAB27B damit mit interzellulärer Kommunikation und Signalgebung im Mikromilieu. Eine Fehlregulation des Rab27b-abhängigen Traffickings wurde mit veränderten Sekretionsprogrammen bei entzündlichen Erkrankungen und in der Krebsbiologie in Zusammenhang gebracht und ist daher relevant für mechanistische Untersuchungen metastaseassoziierter Sekretion, Tumor–Stroma-Interaktionen und Immunmodulation.

Rab 27b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB27B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 27b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB27B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB27B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 27b-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB27B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 27b-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 27b-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB27B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.