Rab 20 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412563-ACT

RAB20 kodiert Rab20, eine kleine GTPase, die den vesikulären Transport im endozytischen System reguliert und Membrantransportereignisse koordiniert, welche das Rezeptor-Recycling, die Reifung von Endosomen und kompartimentiertes Signaling beeinflussen. Durch den Wechsel zwischen GTP- und GDP-gebundenen Zuständen trägt Rab20 dazu bei, Vesikelknospung, -beweglichkeit und -fusion zu organisieren, indem es mit Effektoren interagiert, die Transportprozesse an Zytoskelett-Dynamik und Organellenfunktion koppeln. Eine veränderte Aktivität des Rab-GTPase-Netzwerks, einschließlich einer Dysregulation von RAB20, wurde in verschiedenen experimentellen Kontexten mit Störungen der zellulären Homöostase in Verbindung gebracht, etwa mit metabolischer Anpassung, inflammatorischer Signalgebung und onkogenen Phänotypen. Daher wird RAB20 häufig in Signalwegen untersucht, die den intrazellulären Transport mit Stressantworten und krankheitsrelevanten Zellzuständen verknüpfen.

Rab 20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB20-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB20-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB20-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 20-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB20-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 20-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 20-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB20-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.