Rab 1A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401515-ACT

RAB1A kodiert die kleine GTPase Rab1A, einen zentralen Regulator des ER-zu-Golgi-Transports, der das Anheften (Tethering), Andocken und die Fusion von COPII-Vesikeln koordiniert, um den Fluss im sekretorischen Weg und die Homöostase der Organellen aufrechtzuerhalten. Durch die Kontrolle der Dynamik des Membrantransports beeinflusst Rab1A die Golgi-Organisation, die Verarbeitung von Glykoproteinen, autophagieassoziierte Transportereignisse sowie umfassendere Proteostase-Netzwerke. Störungen des RAB1A-vermittelten Transports wurden mit zellulären Stressantworten und fehlregulierter Wachstumssignalgebung in Verbindung gebracht und sind daher relevant für Studien zu Defekten im vesikulären Transport, Proteostase-Ungleichgewichten und Pathway-Rewiring in Krankheitsmodellen. Als konservierter Knotenpunkt der intrazellulären Logistik wird Rab1A häufig in funktionellen Genomik-Workflows untersucht, die Transportphänotypen mit Signal- und Stoffwechsel-Outputs verknüpfen.

Rab 1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAB1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rab 1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAB1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAB1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rab 1A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAB1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rab 1A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rab 1A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAB1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.