Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 11A: sc-400617-ACT

RAB11A code la petite GTPase Rab11A, un régulateur central de la dynamique des endosomes de recyclage, qui coordonne le bourgeonnement des vésicules, leur transport et leur arrimage à la membrane plasmique. Rab11A contrôle la livraison polarisée de membrane, le recyclage des récepteurs, la cytokinèse et la formation de la lumière épithéliale en recrutant des protéines interagissant avec la famille Rab11 (FIP) et en se couplant à des moteurs dépendants de l’actine et des microtubules. Grâce à ces fonctions de trafic, Rab11A module les sorties de signalisation des récepteurs de surface et des intégrines et contribue aux décisions de tri endocytique qui façonnent la migration et la polarité cellulaires. Un recyclage dépendant de Rab11A dérégulé a été associé à des phénotypes pertinents pour la transformation oncogénique, les processus neurodégénératifs et les interactions hôte–pathogène, dans lesquelles le trafic membranaire et la compartimentation sont perturbés.

Rab 11A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB11A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 11A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB11A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB11A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 11A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB11A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 11A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 11A dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB11A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.