Plasmide CRISPR d'Activation (h) R-Spondin3: sc-404472-ACT

RSPO3 code pour R-Spondine 3, un potentialisateur sécrété de la signalisation canonique Wnt/β-caténine, qui amplifie l’activité de la voie en se liant aux récepteurs LGR et en neutralisant les ligases E3 ubiquitine RNF43/ZNRF3 afin de stabiliser les récepteurs Frizzled/LRP à la surface cellulaire. Par ce mécanisme, R-Spondine 3 régule la prolifération épithéliale, le maintien des cellules souches et le remodelage tissulaire, en influençant les programmes du développement et l’homéostasie des organes. L’activité de RSPO3 s’articule avec la matrice extracellulaire et les signaux des facteurs de croissance pour façonner les interactions angiogéniques et stromales au sein de microenvironnements tissulaires variés. Une expression dérégulée de RSPO3 ou un couplage anormal de la voie est impliqué dans la biologie des maladies dépendantes de Wnt, notamment dans des contextes de contrôle aberrant du destin cellulaire et de réseaux de signalisation associés aux tumeurs.

R-Spondin3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RSPO3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

R-Spondin3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RSPO3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RSPO3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de R-Spondin3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RSPO3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de R-Spondin3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie R-Spondin3 dans les cellules tumorales présentant une expression de RSPO3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.