PYGB CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406294-ACT

Das humane PYGB-Gen kodiert die Gehirn-Isoform der Glykogenphosphorylase, ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym, das den Abbau von Glykogen katalysiert, um Glukose-1-phosphat zu erzeugen und die zelluläre Energieversorgung aufrechtzuerhalten. Indem PYGB die Mobilisierung von Glykogen mit der Glykolyse und dem weiteren Kohlenhydratstoffwechsel verknüpft, unterstützt es die metabolische Flexibilität bei schwankender Nährstoff- oder Sauerstoffverfügbarkeit. Die PYGB-Aktivität ist in Signalnetzwerke eingebunden, die die Energiehomöostase feinabstimmen, darunter AMP/ATP-Sensing und stressresponsive Signalwege, die das Zellüberleben und die Proliferation beeinflussen. Eine dysregulierte Glykogenverwertung und eine veränderte PYGB-Expression wurden im Kontext metabolischer Anpassung sowie der krebsassoziierten Umprogrammierung der Energienutzung beobachtet, was PYGB zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Untersuchungen der Bioenergetik macht.

PYGB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PYGB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PYGB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PYGB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PYGB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PYGB-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PYGB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PYGB-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PYGB-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PYGB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.