PTRF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404669-ACT

Humanes CAVIN1 (PTRF) kodiert den Polymerase‑I‑ und Transcript‑Release‑Faktor, eine zentrale Komponente der Cavin‑Familie, die für die Biogenese von Caveolae und deren Stabilisierung an der Plasmamembran erforderlich ist. PTRF koordiniert caveolinabhängige Membrankrümmung, Mechanoprotektion und caveolae‑vermittelte Endozytose und beeinflusst dadurch die Kompartimentierung von Signalwegen sowie die Lipidhomöostase. Über seine Rolle bei der Organisation von Membranmikrodomänen wirkt PTRF auf Signalwege ein, die mit Insulinsignalisierung, Adipozytendifferenzierung und zytoskelettaler Dynamik verknüpft sind. Veränderte Funktion oder Expression von CAVIN1/PTRF wurde mit lipodystrophieassoziierten Phänotypen, muskulären Auffälligkeiten und einer gestörten Zellsignalisierung in Zusammenhang gebracht, die für die Krebsbiologie sowie die Forschung zu Stoffwechselerkrankungen relevant ist.

PTRF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CAVIN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PTRF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CAVIN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CAVIN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PTRF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CAVIN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PTRF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PTRF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CAVIN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.