PTPLAD2 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-417162-ACT-2

Das humane HACD4 (das für PTPLAD2 kodiert) ist ein mutmaßliches Enzym mit Ähnlichkeit zu 3‑Hydroxyacyl‑CoA‑Dehydratasen, das an der Elongation sehr langkettiger Fettsäuren beteiligt ist und damit mit der Homöostase des Lipidstoffwechsels, der Membranbiogenese sowie Prozessen im Zusammenhang mit dem endoplasmatischen Retikulum verknüpft wird. Über seine vorhergesagte Rolle beim Fettsäure‑Remodeling ist HACD4/PTPLAD2 relevant für Signal- und Stoffwechselwege, die die Phospholipidzusammensetzung, die Integrität von Organellen und zelluläre Stressantworten steuern, welche Proliferation und Differenzierung beeinflussen. Eine veränderte Regulation von Lipid‑Elongationsnetzwerken und PTPLAD2‑assoziierte Signaturen wurden in Kontexten metabolischer Dysfunktion und der krebsbezogenen Biologie beschrieben, was seinen Nutzen als mechanistischen Knotenpunkt für die Untersuchung lipidgetriebener Phänotypen stützt. Das Gene Editing von HACD4 ermöglicht die funktionelle Aufschlüsselung des VLCFA‑Stoffwechsels, die Untersuchung nachgeschalteter Signalwege sowie transkriptomischer Anpassungen und die Entwicklung von Zellmodellen für Forschung zu Lipidomik, ER‑Stress und Membrandynamik.

PTPLAD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HACD4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PTPLAD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HACD4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HACD4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PTPLAD2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HACD4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PTPLAD2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PTPLAD2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HACD4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.