PRP4 kinase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411224-ACT

PRPF4B kodiert die PRP4-Kinase, eine Serin/Threonin-Proteinkinase, die mit spliceosomalen Komplexen assoziiert ist und das Spleißen von prä-mRNA sowie die Dynamik des Spleißosoms unterstützt. Durch die Phosphorylierung spleißrelevanter Faktoren trägt die PRP4-Kinase zur Regulation alternativer Spleißmuster bei, die die Transkriptom-Ausgabe während des Zellzyklusverlaufs und bei Stressantworten prägen. Eine Störung der PRPF4B-Aktivität kann die Zuverlässigkeit der RNA-Prozessierung und nachgeschaltete Genexpressionsprogramme verändern und verknüpft diese Kinase damit mit Signalwegen, die für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität und für Signalnetzwerke relevant sind. Fehlregulierte Spleißprogramme unter Beteiligung von PRPF4B wurden im Zusammenhang mit Proliferations- und Differenzierungsphänotypen untersucht, was es zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der RNA-Prozessierung in humanen Zellen macht.

PRP4 kinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRPF4B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PRP4 kinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRPF4B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRPF4B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PRP4 kinase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRPF4B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PRP4 kinase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PRP4 kinase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRPF4B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.