PRA1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404295-ACT

Humanes RABAC1 kodiert PRA1, einen prenylierten Rab-Akzeptor, der als Regulator des Rab-GTPase-abhängigen Transports und der Membrandynamik fungiert. PRA1 ist am endomembranären Transport beteiligt, indem es die Rab-Lokalisierung und den Rab-Zyklus moduliert und dadurch den ER–Golgi-Transport, das Andocken von Vesikeln sowie die Sortierung von Fracht entlang sekretorischer und endozytotischer Wege beeinflusst. Über diese Funktionen ist RABAC1 mit der Proteostase und zellulären Stressantworten verknüpft, die auf einen koordinierten Vesikeltransport angewiesen sind. Eine Fehlregulation Rab-vermittelter Transportprozesse und der Kontrolle des sekretorischen Weges wird häufig mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für die Krebszellbiologie und die Neurodegenerationsforschung relevant sind, wodurch PRA1 einen nützlichen Ansatzpunkt für mechanistische Studien darstellt.

PRA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RABAC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PRA1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RABAC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RABAC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PRA1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RABAC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PRA1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PRA1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RABAC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.