PP2Cκ CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433975-ACT

Ppm1k kodiert die mitochondriale Phosphatase PP2Cκ, ein Mg2+/Mn2+-abhängiges Enzym der PP2C-Familie, das den oxidativen Stoffwechsel reguliert, indem es zentrale Zielproteine dephosphoryliert, die am Abbau verzweigtkettiger Aminosäuren (BCAA) beteiligt sind. Insbesondere moduliert PP2Cκ die Aktivität des Komplexes der verzweigtkettigen α-Ketosäure-Dehydrogenase (BCKDH) und verknüpft damit den mitochondrialen Nährstofffluss mit der zellulären Energiehomöostase. Aufgrund seiner Effekte auf die BCAA-Verwertung und die mitochondriale Funktion wird Ppm1k im Kontext metabolischer Stressantworten und gewebespezifischer Bioenergetik untersucht, einschließlich Modellen mit Bezug zur Insulinsensitivität, zum Fett- und Muskelstoffwechsel sowie zu Phänotypen im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion. Eine Fehlregulation dieses Signalwegs ist in experimentellen Systemen mit einer veränderten Aminosäurehomöostase und mit für Stoffwechselerkrankungen relevanten Signalzuständen assoziiert.

PP2Cκ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ppm1k-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PP2Cκ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ppm1k-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ppm1k-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PP2Cκ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ppm1k-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PP2Cκ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PP2Cκ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ppm1k-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.