Plásmido CRISPR de Activación (h) PP2B-Aβ: sc-402853-ACT

PPP3CB codifica la subunidad beta catalítica de la calcineurina (PP2B-Aβ), una fosfatasa de serina/treonina dependiente de Ca2+/calmodulina que acopla las señales intracelulares de calcio a respuestas transcripcionales y postraduccionales. La calcineurina desfosforila factores de transcripción de la familia NFAT para regular programas génicos implicados en la señalización inmunitaria, la plasticidad sináptica y la adaptación al estrés celular, y también se interconecta con vías de MAPK, Wnt y remodelación del citoesqueleto. La actividad desregulada de PPP3CB se ha relacionado con alteraciones de la excitabilidad neuronal y fenotipos del neurodesarrollo, y la señalización aberrante de la calcineurina se estudia en la inflamación, la hipertrofia de cardiomiocitos y las transiciones de estado en células cancerosas. Como nodo central en la señalización dependiente de calcio, PP2B-Aβ ofrece un punto de acceso manejable para diseccionar circuitos transcripcionales dependientes de señales y redes reguladas por fosfatasas.

PP2B-Aβ El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PPP3CB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PP2B-Aβ El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PPP3CB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PPP3CB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PP2B-Aβ. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PPP3CB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PP2B-Aβ en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PP2B-Aβ en células tumorales con expresión de PPP3CB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.