Plasmide CRISPR d'Activation (h) PP2A-Aβ: sc-403081-ACT

PPP2R1B code la sous-unité d’échafaudage PP2A-Aβ, un composant central des complexes de la protéine phosphatase 2A qui organisent les sous-unités catalytiques et régulatrices afin de coordonner la déphosphorylation des résidus sérine/thréonine. En modulant l’assemblage de l’holoenzyme, PP2A-Aβ influence des réseaux de transduction du signal qui contrôlent la progression du cycle cellulaire, les réponses aux dommages de l’ADN et la dynamique du cytosquelette, avec des effets en aval sur les états de phosphorylation associés aux voies MAPK, AKT et Wnt/β-caténine. Une altération de la fonction d’échafaudage de PP2A peut perturber l’équilibre de la signalisation des phosphatases et a été associée à une prolifération dérégulée et à une instabilité génomique dans des contextes pertinents pour le cancer. PPP2R1B est donc fréquemment étudié pour son rôle dans le maintien de l’homéostasie du phosphoprotéome et des interactions entre voies de signalisation dans les cellules humaines.

PP2A-Aβ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP2R1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PP2A-Aβ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP2R1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP2R1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PP2A-Aβ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP2R1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PP2A-Aβ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PP2A-Aβ dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP2R1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.