POH1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405591-ACT

PSMD14 kodiert POH1, eine JAMM/MPN+-Metalloprotease-Untereinheit des 19S-Regulatorpartikels des humanen 26S-Proteasoms, die während der Substratverarbeitung K48-verknüpfte Ubiquitinketten entfernt. Durch die Kopplung von Deubiquitinierung an die proteasomale Degradation trägt POH1 zur Aufrechterhaltung der Protein-Homöostase bei und beeinflusst den Umsatz zentraler Regulatoren, die an DNA-Schadensantworten, Zellzyklusprogression und stressadaptiver Signalgebung beteiligt sind. Die PSMD14-Aktivität steht in Wechselwirkung mit der ubiquitinabhängigen Kontrolle chromatinassoziierter Prozesse und kann Signalwege wie die NF-κB-Signalgebung durch regulierten Abbau von Komponenten des Signalwegs beeinflussen. Eine Fehlregulation der proteasomassoziierten Deubiquitinierung wurde mit aberranter Proteostase und Phänotypen der Genomstabilität in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und die Forschung zu Neurodegeneration relevant sind.

POH1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PSMD14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

POH1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PSMD14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PSMD14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen POH1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PSMD14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von POH1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des POH1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PSMD14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.