Podocin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400930-ACT

NPHS2 codifica a podocina, uma proteína integral de membrana enriquecida no diafragma de fenda dos podócitos renais, onde atua como plataforma (scaffold) para componentes de sinalização e estruturais necessários à integridade da barreira de filtração glomerular. A podocina interage com a nefrina e com a CD2AP em microdomínios de lipid rafts para sustentar a dinâmica do citoesqueleto de actina, a mecanossensibilidade e a manutenção de junções celulares especializadas. A desorganização do diafragma de fenda dependente de NPHS2 compromete a homeostase dos podócitos e está fortemente associada a fenótipos de doença renal proteinúrica, o que a torna um ponto-chave para estudar a falha da barreira de filtração. Por isso, o NPHS2 é amplamente utilizado para investigar a diferenciação de podócitos, vias de sinalização nas junções e relações genótipo–fenótipo na biologia glomerular.

Podocin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NPHS2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Podocin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NPHS2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NPHS2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Podocin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NPHS2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Podocin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Podocin em células tumorais com expressão de NPHS2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.