PNK CRISPR Activationプラスミド (h): sc-404266-ACT

ヒトPNKPは、ポリヌクレオチドキナーゼ3′-ホスファターゼ（PNK）をコードしており、DNA一本鎖切断修復におけるライゲーションに必要な5′リン酸末端および3′ヒドロキシル末端を再生する、二機能性のDNA末端処理酵素です。PNKはPARP1およびXRCC1の下流で機能し、活性酸素種、電離放射線、ならびにトポイソメラーゼ反応の中断によって生じた損傷DNA末端を整えることで、塩基除去修復および非相同末端結合とも連携します。これらの経路を通じて、PNKPはゲノム安定性の維持に寄与し、増殖細胞および非分裂（終末分化）細胞における正常な複製と転写を支えます。PNKPを介した末端処理の破綻は、遺伝毒性ストレスに対する感受性の亢進と関連し、DNA修復能の低下に起因する神経発生および神経変性の表現型とも関連づけられています。

PNK CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性PNKPの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

PNK CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における PNKP 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPNKP転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性PNKの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPNKP遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるPNK依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPNKP発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるPNK経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。