plasma kallikrein CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402237-ACT

KLKB1 kodiert Plasma-Kallikrein, eine Serinprotease, die im Kontaktaktivierungssystem wirkt und die intrinsische Gerinnung, die Fibrinolyse sowie inflammatorische Signalwege reguliert. Nach Aktivierung spaltet Plasma-Kallikrein hochmolekulares Kininogen und setzt dabei Bradykinin frei, wodurch die KLKB1-Aktivität mit Gefäßpermeabilität, Ödembiologie und zytokinmodulierenden Signalwegen verknüpft ist. Es beteiligt sich zudem an einer wechselseitigen Aktivierung mit dem Gerinnungsfaktor XII und kann über proteolytisches Cross-Talk die Signalgebung über Protease-aktivierte Rezeptoren sowie komplementbezogene Kaskaden beeinflussen. Eine dysregulierte Aktivität des Kallikrein-Kinin-Systems wird mit Störungen bradykininvermittelter Entzündung und angioödemähnlichen Phänotypen in Verbindung gebracht, was KLKB1 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien zur Kopplung von Hämostase und Entzündung macht.

plasma kallikrein Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KLKB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

plasma kallikrein Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KLKB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KLKB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen plasma kallikrein-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KLKB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von plasma kallikrein-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des plasma kallikrein-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KLKB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.