PKD2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-430381-ACT

Prkd2 kodiert die Proteinkinase D2 (PKD2), eine Serin/Threonin-Kinase der CAMK-ähnlichen PKD-Familie, die Signale stromabwärts von Diacylglycerol und der Proteinkinase C weiterleitet. PKD2 reguliert eine phosphorylierungsabhängige Kontrolle der Genexpression, den Vesikeltransport aus dem trans-Golgi-Netzwerk, den Umbau des Zytoskeletts sowie stressresponsive Überlebensprogramme und integriert dabei Eingänge aus GPCR- und Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalwegen. In Mauszellen wurde die PKD2-Aktivität mit Signalwegen in Verbindung gebracht, die die Aktivierung von Immunzellen, inflammatorische Signalgebung und Zellmigration steuern, unter anderem durch Modulation von MAPK- und NF-κB-assoziierten transkriptionellen Outputs. Eine dysregulierte PKD2-Signalgebung wird in Kontexten wie aberranter Proliferation, Gewebeumbau und Mechanismen entzündlicher Erkrankungen untersucht, was ihre Eignung als Knotenpunkt zur Analyse von Signalwegen unterstreicht.

PKD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Prkd2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PKD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Prkd2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Prkd2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PKD2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Prkd2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PKD2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PKD2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Prkd2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.