Plasmide CRISPR d'Activation (m2) PKC zeta: sc-422266-ACT-2

Le gène murin Prkcz code la protéine kinase C zêta (PKCζ), une isoforme atypique de PKC qui agit comme une kinase sérine/thréonine régulant la polarité cellulaire, la prolifération et la survie via des voies de signalisation dépendantes de la phosphorylation. PKCζ s’intègre aux voies PI3K–Akt et NF-κB et coopère avec les complexes de polarité PAR pour contrôler l’organisation des jonctions serrées, l’architecture épithéliale et la migration dirigée. Une activité PRKCZ dérégulée a été associée à la signalisation inflammatoire, à des défauts d’homéostasie métabolique et à des processus oncogéniques tels qu’une altération du contrôle de la croissance et une augmentation de l’invasion dans divers systèmes modèles. L’édition génomique ciblant Prkcz chez la souris permet des études mécanistiques des réseaux de signalisation dépendants des kinases, de l’établissement de la polarité et de phénotypes immunitaires ou métaboliques dans des lignées cellulaires, des organoïdes et des modèles in vivo.

PKC zeta Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Prkcz sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKC zeta Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Prkcz dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Prkcz, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKC zeta. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Prkcz natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKC zeta au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKC zeta dans les cellules tumorales présentant une expression de Prkcz silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.