PKC nu CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403822-ACT

PRKD3 kodiert die Proteinkinase D3 (PKC nu), eine Serin/Threonin-Kinase, die nachgeschaltet der diacylglycerolabhängigen PKC-Signalübertragung wirkt und Phosphorylierungsnetzwerke reguliert, welche Zellproliferation, Überleben, Migration und vesikulären Transport steuern. PKC nu beteiligt sich an der Integration von Signalen aus GPCR- und Rezeptor-Tyrosinkinase-Eingängen und trägt zu MAPK/ERK- und NF-κB-gekoppelten transkriptionellen Antworten bei; zudem hat es weitere Funktionen beim Zytoskelett-Umbau und beim Transport vom Golgi zur Plasmamembran. Eine veränderte PRKD3-Aktivität wurde in mehreren Krebszusammenhängen mit fehlregulierter Wachstumsfaktor-Signalgebung und invasiven Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch es einen nützlichen Knotenpunkt zur Untersuchung der Umverdrahtung onkogener Signalwege darstellt. In menschlichen Zellmodellen wird die Perturbation von PRKD3 häufig eingesetzt, um die kinasegetriebene Kontrolle von Stressantworten, Motilitätsprogrammen und transkriptioneller Regulation zu untersuchen.

PKC nu Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKD3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PKC nu Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKD3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKD3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PKC nu-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKD3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PKC nu-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PKC nu-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKD3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.