Plasmide CRISPR d'Activation (h) PKC gamma: sc-400503-ACT

PRKCG code la protéine kinase C gamma (PKCγ), une sérine/thréonine kinase conventionnelle dépendante du Ca2+ et du diacylglycérol, enrichie dans les tissus neuronaux, qui transmet des signaux en aval de la phospholipase C et du renouvellement des phosphoinositides médié par les récepteurs. PKCγ phosphoryle divers substrats pour moduler la signalisation synaptique, la dynamique du cytosquelette et l’expression génique dépendante de l’activité, en intégrant des signaux de seconds messagers au sein des réseaux de kinases MAPK/ERK et d’autres voies. Dans le système nerveux central, l’activité de PRKCG influence la neurotransmission et la plasticité neuronale, et une dérégulation a été associée à des phénotypes neurodégénératifs et neurodéveloppementaux, notamment des ataxies héréditaires. Ces propriétés font de PRKCG un nœud pertinent pour disséquer les mécanismes de transduction du signal et les interactions entre voies dans des modèles cellulaires et neuronaux humains.

PKC gamma Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKCG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKC gamma Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKCG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKCG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKC gamma. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKCG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKC gamma au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKC gamma dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKCG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.