Plasmide CRISPR d'Activation (h) PKC eta: sc-402297-ACT

PRKCH code la protéine kinase C eta (PKCη), une nouvelle sérine/thréonine kinase de la famille PKC, activée en aval d’une signalisation dépendante du diacylglycérol et intégrée aux voies médiées par les phospholipides. PKCη contribue à la régulation de la différenciation des kératinocytes, au contrôle de la croissance des cellules épithéliales, au remodelage du cytosquelette et à la signalisation en réponse au stress, avec des rôles dépendants du contexte dans des programmes transcriptionnels liés aux voies MAPK et NF-κB. Dans les tissus immunitaires et de barrière, l’activité de PRKCH influence les états d’activation cellulaires et les sorties de signalisation inflammatoire, ce qui la rend pertinente pour des études mécanistiques de la prolifération et de la différenciation dérégulées ainsi que de phénotypes associés à l’inflammation. Des altérations de l’expression ou de la signalisation de PRKCH ont été étudiées dans la biologie des maladies, où l’équilibre des isoformes de PKC affecte le comportement cellulaire, ce qui étaye son utilisation comme nœud fonctionnel pour l’interrogation des voies de signalisation.

PKC eta Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKCH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKC eta Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKCH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKCH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKC eta. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKCH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKC eta au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKC eta dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKCH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.