PKC eta CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402297-ACT

PRKCH kodiert die Proteinkinase C eta (PKCη), eine neuartige Serin/Threonin-Kinase der PKC-Familie, die nachgeschaltet von diacylglycerolabhängigen Signalwegen aktiviert wird und in phospholipidvermittelte Signalwege integriert ist. PKCη trägt zur Regulation der Keratinozytendifferenzierung, zur Kontrolle des Wachstums epithelialer Zellen, zum Umbau des Zytoskeletts sowie zu stressresponsiver Signalübertragung bei und übernimmt kontextabhängige Rollen in MAPK- und NF-κB-gekoppelten Transkriptionsprogrammen. In Immun- und Barrieregeweben beeinflusst die PRKCH-Aktivität zelluläre Aktivierungszustände und die Ausprägung inflammatorischer Signale, was sie für mechanistische Studien zu fehlregulierter Proliferation, Differenzierung und entzündungsassoziierten Phänotypen relevant macht. Eine veränderte PRKCH-Expression oder -Signalübertragung wurde in der Krankheitsbiologie untersucht, in der die Balance der PKC-Isoformen das Zellverhalten beeinflusst, was PRKCH als funktionellen Knotenpunkt für die Analyse von Signalwegen unterstützt.

PKC eta Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKCH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PKC eta Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKCH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKCH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PKC eta-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKCH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PKC eta-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PKC eta-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKCH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.