Plasmide CRISPR d'Activation (h) PKC alpha: sc-400128-ACT

PRKCA code la protéine kinase C alpha (PKC alpha), une kinase sérine/thréonine classique, sensible au calcium et au diacylglycérol, qui transmet les signaux en aval de la phospholipase C afin de réguler, via des mécanismes dépendants de la phosphorylation, la croissance et la différenciation cellulaires, le remodelage du cytosquelette et le trafic vésiculaire. PKC alpha intègre des signaux médiés par des récepteurs pour moduler la signalisation MAPK/ERK, l’activité de NF-κB et les boucles de rétroaction au sein des réseaux PI3K–AKT, façonnant ainsi les programmes transcriptionnels et les réponses cellulaires au stress. Des altérations de l’expression de PRKCA ou de la signalisation de PKC alpha ont été associées à une prolifération dérégulée, à l’invasion et à une signalisation inflammatoire dans de multiples contextes liés à des maladies, ce qui en fait une cible fréquemment utilisée pour l’exploration mécanistique des voies de signalisation. Dans les systèmes modèles humains, la perturbation de PRKCA permet d’étudier la dynamique de la transduction du signal, les relations kinase–substrat et les interactions (crosstalk) entre voies dépendantes du contexte.

PKC alpha Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKCA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKC alpha Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKCA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKCA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKC alpha. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKCA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKC alpha au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKC alpha dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKCA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.