Plásmido CRISPR de Activación (h) PKA IIα reg: sc-401080-ACT

PRKAR2A codifica la subunidad reguladora IIα de la proteína quinasa A (PKA) dependiente de AMPc, un modulador clave de la actividad quinasa que, en ausencia de AMPc, mantiene restringidas las subunidades catalíticas y ajusta la amplitud y la compartimentalización de la señalización. Mediante interacciones de anclaje con andamiajes AKAP, PRKAR2A contribuye a localizar la PKA en microdominios subcelulares definidos, moldeando programas de fosforilación que controlan el metabolismo, la progresión del ciclo celular, las respuestas transcripcionales y la señalización sináptica. Este eje AMPc/PKA se interseca con la señalización de receptores acoplados a proteína G (GPCR) y con la regulación génica dependiente de CREB, influyendo en vías de diferenciación y de respuesta al estrés. La desregulación de la señalización de PKA y las alteraciones en el equilibrio de subunidades reguladoras se han asociado con un control anómalo del crecimiento y la reconfiguración de vías observadas en múltiples contextos patológicos, lo que respalda estudios mecanísticos de la transducción de señales y la plasticidad celular.

PKA IIα reg El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PRKAR2A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PKA IIα reg El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PRKAR2A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PRKAR2A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PKA IIα reg. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PRKAR2A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PKA IIα reg en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PKA IIα reg en células tumorales con expresión de PRKAR2A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.