PITSLRE A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402476-ACT

CDK11B kodiert die humane Serin/Threonin-Kinase PITSLRE A, ein Mitglied der CDC2L-Familie, die mit zellzyklusgekoppelter Signalübertragung und der Kontrolle der Transkription in Verbindung gebracht wird. PITSLRE A wurde mit Prozessen assoziiert, die an die RNA-Polymerase II gekoppelt sind, darunter RNA-Spleißen und mRNA-Prozessierung, sowie mit der Koordination von Proliferation und Stressantworten über phosphorylierungsabhängige Proteinnetzwerke. Im Rahmen dieser Regulationskreise werden veränderte Expression oder Aktivität von CDK11B in Zusammenhängen untersucht, die durch entgleistes Zellwachstum, Genomstabilität und apoptosebezogene Signalwege geprägt sind, welche in der Krankheitsbiologie häufig gestört sind. CDK11B ist daher ein nützliches Ziel, um die kinasegetriebene Steuerung von Genexpressionsprogrammen und Zellzustandsübergängen in humanen Modellsystemen zu analysieren.

PITSLRE A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDK11B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PITSLRE A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDK11B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDK11B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PITSLRE A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDK11B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PITSLRE A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PITSLRE A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDK11B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.