PIF1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403130-ACT

Das humane PIF1 kodiert eine 5′→3′-DNA-Helikase, die zur Erhaltung der Genomstabilität beiträgt, indem sie G-Quadruplex-Strukturen auflöst, aberrante DNA-Zwischenprodukte entwindet und Replikations–Transkriptions-Konflikte begrenzt. PIF1 wirkt an gestoppten Replikationsgabeln und trägt zum Wiederanlaufen der DNA-Replikation, zur Prozessierung von Okazaki-Fragmenten sowie zur Unterdrückung unangemessener Rekombination bei und ist damit mit zentralen Signalwegen der DNA-Schadensantwort und des Replikationsstresses verknüpft. Über Funktionen im Telomerstoffwechsel und in der Erhaltung der mitochondrialen DNA kann eine veränderte PIF1-Aktivität die Telomerintegrität und die Stabilität des mitochondrialen Genoms beeinflussen. Eine Fehlregulation dieser Prozesse ist relevant für mechanistische Untersuchungen von Genominstabilitäts-Phänotypen, wie sie bei verschiedenen Krebsarten und anderen mit Replikationsstress assoziierten Erkrankungen beobachtet werden.

PIF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PIF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PIF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PIF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PIF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PIF1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PIF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PIF1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PIF1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PIF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.