Plasmide CRISPR d'Activation (h) Phox2b: sc-401351-ACT

PHOX2B code le facteur de transcription à homéoboîte Phox2b, un régulateur déterminant de lignée indispensable à la spécification et au maintien des programmes neuronaux autonomes et noradrénergiques au cours du développement. Phox2b coordonne des réseaux transcriptionnels qui gouvernent la différenciation neuronale, le guidage axonal et l’expression des gènes catécholaminergiques, notamment des voies associées aux devenirs cellulaires dérivés de la crête neurale et aux circuits du tronc cérébral impliqués dans le contrôle respiratoire. Des altérations génétiques ou une expression dérégulée de PHOX2B sont liées aux neurocristopathies et aux tumeurs pédiatriques issues de la crête neurale, notamment le syndrome d’hypoventilation alvéolaire centrale congénitale et certains sous-types de neuroblastome. Ces caractéristiques font de PHOX2B un nœud clé pour étudier le contrôle transcriptionnel du développement du système nerveux autonome et des états de différenciation neuronale pertinents pour la maladie.

Phox2b Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PHOX2B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Phox2b Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PHOX2B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PHOX2B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Phox2b. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PHOX2B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Phox2b au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Phox2b dans les cellules tumorales présentant une expression de PHOX2B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.