Phox2b CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401351-ACT

PHOX2B kodiert den Homeobox-Transkriptionsfaktor Phox2b, einen schicksalsbestimmenden Regulator, der während der Entwicklung für die Festlegung und Aufrechterhaltung autonomer und noradrenerger neuronaler Programme erforderlich ist. Phox2b koordiniert Transkriptionsnetzwerke, die neuronale Differenzierung, Axonführung und die Expression katecholaminerger Gene steuern, einschließlich Signalwege, die mit Schicksalen von Neuralleisten-abgeleiteten Zellen und Schaltkreisen der respiratorischen Kontrolle im Hirnstamm assoziiert sind. Genetische Veränderungen oder eine fehlregulierte Expression von PHOX2B stehen mit Neurokristopathien und pädiatrischen Neuralleisten-Tumoren in Zusammenhang, darunter das kongenitale zentrale Hypoventilationssyndrom und bestimmte Subgruppen des Neuroblastoms. Diese Eigenschaften machen PHOX2B zu einem zentralen Knotenpunkt für die Erforschung der transkriptionellen Kontrolle der Entwicklung des autonomen Nervensystems und krankheitsrelevanter neuronaler Differenzierungszustände.

Phox2b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PHOX2B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Phox2b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PHOX2B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PHOX2B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Phox2b-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PHOX2B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Phox2b-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Phox2b-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PHOX2B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.