PHF19 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408215-ACT

PHF19 (PHD-Finger-Protein 19) ist ein chromatinassoziierter Regulator, der mit dem Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) interagiert, um die Ablagerung von H3K27me3 zu modulieren und Programme der Transkriptionsrepression aufrechtzuerhalten. Über seine Funktionen als epigenetischer „Reader“ und bei der Rekrutierung trägt PHF19 zur Kontrolle von Zellidentität, Proliferation und Differenzierung bei, indem es die Chromatinzugänglichkeit und Genexpressionszustände mitgestaltet. Eine Fehlregulation der PHF19-Expression oder PRC2-gekoppelter Chromatinwege wird in mehreren Krebs-Kontexten mit onkogenen Transkriptionsprogrammen und einer veränderten Linienfestlegung in Verbindung gebracht. Als Knotenpunkt der Polycomb-vermittelten Stilllegung wird PHF19 häufig hinsichtlich seines Einflusses auf entwicklungsbezogene Gennetzwerke, Chromatin-Remodeling und transkriptionelle Plastizität untersucht.

PHF19 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PHF19-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PHF19 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PHF19-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PHF19-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PHF19-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PHF19-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PHF19-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PHF19-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PHF19-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.