PFKFB4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410933-ACT

Humanes PFKFB4 kodiert die 6-Phosphofructo-2-kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase 4, ein bifunktionales Enzym, das die zellulären Spiegel von Fructose-2,6-bisphosphat steuert und dadurch den glykolytischen Fluss über eine allosterische Regulation von PFK1 fein abstimmt. Durch die Modulation des Kohlenstoffflusses zwischen Glykolyse und damit verbundenen Stoffwechselprodukten trägt PFKFB4 zur metabolischen Anpassung unter Stressbedingungen wie Hypoxie und Nährstofflimitierung bei, mit nachgelagerten Effekten auf das Redoxgleichgewicht und die biosynthetische Kapazität. Veränderte Expression und Aktivität von PFKFB4 wurden mit der metabolischen Umprogrammierung in verschiedenen krankheitsrelevanten Kontexten in Verbindung gebracht, insbesondere in Modellen proliferativer Signalgebung und mikroenvironmentalen Stresses. Daher wird PFKFB4 häufig in Signalwegen untersucht, die Glykolyse, HIF-regulierte Antworten und Wachstumskontrolle miteinander verknüpfen.

PFKFB4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PFKFB4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PFKFB4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PFKFB4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PFKFB4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PFKFB4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PFKFB4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PFKFB4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PFKFB4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PFKFB4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.