PDZ-RhoGEF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403444-ACT

ARHGEF11 kodiert PDZ-RhoGEF, einen RhoA-spezifischen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, der aktivierte Gα12/13-Signalgebung mit der Aktivierung von RhoA und nachgeschaltetem Zytoskelett-Remodeling koppelt. Durch die Förderung der Output-Signalgebung des RhoA–ROCK‑Signalwegs reguliert PDZ-RhoGEF die Bildung von Aktin-Stressfasern, die Dynamik fokaler Adhäsionen, Zellpolarität und Kontraktilität und beeinflusst damit Prozesse wie Zellmigration und die Organisation von Zell-Zell-Kontakten. Die mit ARHGEF11 verknüpfte Signalgebung überschneidet sich mit GPCR-Netzwerken und Mechanotransduktionswegen, die die Gewebearchitektur und Entzündungsreaktionen prägen. Eine Fehlregulation der Rho‑GTPase‑Signalgebung unter Beteiligung von PDZ-RhoGEF wurde mit veränderter Motilität und Invasivität in der Krebsbiologie sowie mit vaskulären und metabolischen Phänotypen in genetischen und funktionellen Studien in Verbindung gebracht.

PDZ-RhoGEF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARHGEF11-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDZ-RhoGEF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARHGEF11-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARHGEF11-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDZ-RhoGEF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARHGEF11-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDZ-RhoGEF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDZ-RhoGEF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARHGEF11-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.