PDE3B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401773-ACT

Phosphodiesterase 3B (PDE3B) ist eine zyklische Nukleotidphosphodiesterase mit dualer Substratspezifität, die cAMP und cGMP hydrolysiert, um die Dynamik der Second-Messenger-Signalübertragung in zelltypspezifischer Weise feinzujustieren. Indem PDE3B die cAMP/PKA-Signalgebung begrenzt und Signale aus Insulin-, adrenergen und entzündlichen Inputs integriert, trägt es zur Regulation von Lipolyse, Glukosehomöostase und Energiebilanz bei, mit besonders ausgeprägten Funktionen in Adipozyten sowie in der hepatozytenassoziierten metabolischen Signalübertragung. Die PDE3B-Aktivität beeinflusst nachgeschaltete Transkriptionsprogramme und Phosphorylierungsnetzwerke, die den Lipidstoffwechsel, die mitochondriale Funktion und zytokinresponsive Signalwege betreffen. Eine fehlregulierte PDE3B-Expression oder -Signalgebung wurde mit Phänotypen metabolischer Erkrankungen und kardiometabolischen Risikopfaden in Verbindung gebracht, was PDE3B als mechanistischen Knotenpunkt in Studien zur Insulinresistenz und verwandten Störungen unterstützt.

PDE3B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PDE3B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDE3B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PDE3B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PDE3B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDE3B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PDE3B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDE3B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDE3B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PDE3B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.